Проведено обобщение полученных данных по выходу стабильных и нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека при действии ионизирующих излучений разного качества: гамма-лучей (1-7 Гр), ускоренных протонов с энергией 1 Гэв (0.25-3.6 Гр) и ионов азота 14N c ЛПЭ ~ 77 кэВ/мкм (0.5-3 Гр). При исследовании частоты их образования с использованием классического метафазного и FISH-методов, с одной стороны, подтверждены некоторые ранее известные закономерности. Так, выход обменных аберраций стабильного и нестабильного типа (транслокации и дицентрики) описывался линейно-квадратичной зависимостью от дозы, а ацентрических фрагментов - линейной при действии излучений с низкой ЛПЭ как электромагнитной (гамма-лучи), так и корпускулярной (протоны релятивистских энергий) природы. Выход всех типов аберраций при действии плотноионизирующих ионов азота описывался линейной зависимостью эффекта от дозы. С другой стороны, выявлены новые качественные и количественные особенности действия излучений разного качества. Они касаются спектра индуцированных аберраций. Так, среди аберраций стабильного типа превалировали транслокации, а их вклад в общее число аберраций находился в обратной зависимости от ЛПЭ излучений: при воздействии гамма-лучей и протонов на их долю приходилось 40-45% аберраций, а при облучении ионами азота ~ 25%. Последнее определялось выраженной фрагментацией хромосом при облучении тяжелыми ионами, и в результате наблюдалось относительное снижение доли стабильных хромосомных аберраций. Кроме того, полученные FISH-методом данные свидетельствовали о более высокой частоте повреждения хромосом 1 и 2 генома человека при действии исследованных видов ионизирующего излечения. Они могут служить подтверждением появившихся в последнее время предположений о неодинаковой радиочувствительности разных хромосом человека.

         Полученные данные по индукции стабильных аберраций (транслокаций) хромосом были использованы для построения калибровочных кривых в плане использования таких аберраций в качестве биоиндикаторов для оценки поглощенных доз излучений разного качества. Анализ показал, что в исследованном диапазоне доз точность оценки дозы гамма-лучей и протонов составляет 7-15%, а для ионов азота ~ 20%. Точность оценки повышается с ростом индуцирующей дозы.

          Проведен анализ полученных данных при изучении спонтанных HPRT-мутантов клеток млекопитающих и индуцированных разными дозами излучений разного качества: гамма-лучей, ускоренных протонов с энергией 1 Гэв и ионов азота 14N c ЛПЭ ~ 77 кэВ/мкм. При выявлении и селекции мутантов наблюдалось появление мутантов с замедленным ростом и увеличение доли таких мутантов (до 80-100%) при высоких индуцирующих дозах гамма-излучения (5-7 Гр) и действии плотноионизирующих ионов азота во всем диапазоне исследованных доз (до 3 Гр). При цитогенетическом анализе спонтанных и радиационно-индуцированных мутантных субклонов выявлена их гетерогенность по таким исследованным показателям как митотическая активность, анеуплоидия, повышения уровня хромосомных аберраций. Хромосомная нестабильность мутантных субклонов снижалась с ростом ЛПЭ ионизирующих излучений. Доля мутантов с повышенным уровнем хромосомных аберраций по сравнению с интактным контролем составила:

    среди спонтанных мутантов - 71%, гамма-индуцированных - 47%, индуцированных протонами - 33% и ионами азота - 16%. Наиболее высокой хромосомная нестабильность оказалась у спонтанных мутантов. Среди мутантных субклонов были выявлены группы мутантов, не отличающиеся от контроля по уровню хромосомных аберраций, с повышенным в 2-4 раза их уровнем, с экстремально высоким уровнем аберраций хромосом (более 30% клеток с аберрациями) и тетраплоидные мутанты. При радиационно-индуцированном мутагенезе отмечено появление мутантов со сниженным в 2-4 раза по сравнению с интактным контролем уровнем хромосомных аберраций. Доля таких генетически устойчивых клонов с низким уровнем аберраций хромосом составила: среди гамма-индуцированных мутантов - 16%, индуцированных протонами - 8%, ионами азота 14N - 48%. Среди спонтанных мутантов они не были отмечены. Эти данные могут свидетельствуют о том, что при высоких ЛПЭ излучения увеличивается число генетически устойчивых мутантов.

         Выявленные в наших экспериментах гетерогенность HPRT-мутантов по исследованным цитогенетическим показателям свидетельствует о том, что при мутагенезе в клетках млекопитающих с неизбежностью повышается вероятность нарушения целостности хромосом, что можно рассматривать как этап соответствующей перестройки генома, адекватной изменившимся условиям существования. Вероятно, степень выраженности нестабильности хромосом в клетках мутантов может определяться различиями типов возникающих мутаций.

         Продолжены исследования по эффектам малых доз облучения на клетки млекопитающих. Одним из важнейших аспектов этой проблемы является  возможность экстраполяции эффектов, вызываемых высокими дозами облучения на облучение в области низких доз. Ранее на клетках Китайского хомячка и меланомы человека  с использованием анафазного анализа аберраций хромосом был выявлен нелинейный характер зависимости доза-эффект, характеризующийся гиперчувствительностью при малых дозах (до 10-20 сГр), наличием обратной зависимости от дозы в диапазоне 10-30 сГр и индуцированной радиорезистентностью при более высоких дозах.

         Подтверждение этой "аномальной" дозовой зависимости получено на синхронизированных клетках Китайского хомячка, облученных в G-1 фазе клеточного цикла. Метафазный анализ аберраций хромосом в первом пострадиационном митозе  как по количеству числу клеток с аберрациями, так и по числу аберраций на клетку показал наличие ранее обнаруженных закономерностей.

         Аналогичная зависимость доза-эффект получена на клетках меланомы человека при использовании микроядерного теста, оценивающего реакцию клеточной популяции за весь клеточный цикл.

         При изучении адаптивного ответа клеток меланомы человека  по  критерию аберраций хромосом и по числу клеток с микроядрами установлено, что по микроядерному тесту величина адаптивного ответа выше, чем по индукции хромосомных аберраций - 0.55 и 0.8 соответственно. Предварительное облучение клеток Китайского хомячка и меланомы человека в дозах оптимальных для индукции адаптивного ответа (20 и 1 сГр соответственно) меняет форму  кривой доза-эффект - фаза гиперчувствительности не выявляется и даже имеет место восстановление части спонтанных хромосомных  аберраций.

         На основании полученных данных делается предположение, что в основе нарушения линейности кривой доза-эффект и индукции адаптивного ответа лежат одни и те же процессы индуцибильной репарации, аналогичные по своим механизмам и различающиеся количественно у клеток разного типа.

         Продолжены исследования по мишенной радиотерапии пигментной меланомы человека с использованием гамма-излучающего радионуклида 211At и метиленового синего (МС).  Оценивали степень селективности действия  211At в комплексе с МС на клетки пигментной меланомы по сравнению с непигментированными клетками Китайского хомячка. Критерием оценки служила аккумуляция радионуклида в клетках при их инкубации с 211At-MC  и 211Аt в ионной форме. Установлено, что накопление 211At-MC в клетках меланомы человека происходит в 3-4 раза выше, чем в непигментированных клетках. 211At в ионной форме накапливается обоими типами клеток  одинаково, в очень незначительном количестве. Эти результаты хорошо коррелируют с полученными ранее данными о том, что по критерию выживаемости  клеток эффективность действия комплекса 211At-MC на  клетки меланомы на порядок выше, чем на непигментированные клетки.

         В экспериментах с дрожжевыми клетками  Saccharomyces cerevisiae изучали индукцию мутаций различной молекулярной природы под действием ионизирующей радиации.   В качестве модельной системы для изучения тотального мутагенеза был взят ген CAN1, кодирующий аргининпермеазу и имеющий протяженность 1.8 т.п.о. Получена линейная кривая зависимости образования прямых мутаций в гене CAN1 от дозы при гамма-облучении.

         Для анализа микроделеций использовали возникновение реверсий у штаммов, имеющих мутации сдвига рамки считывания. Использованный в работе штамм несет вставку 4 основания в гене LYS2 и вставку +1Т в последовательность 6Т в гене HOM3. Реверсии к Lys+ и Hom+, по преимуществу, представляют собой выпадение одного нуклеотида. Показано, что гамма-лучи эффективно индуцируют мутации сдвига рамки считывания. Для сравнения приведены частоты индуцированного мутагенеза: частота прямых мутаций резистентности к канаванину (CANr) составляет 5.8x10-5 ; мутации сдвига рамки считывания для   реверсий к Lys+  - 1x10-6 и реверсий к  Hom+ - 1.6х10-7 при дозе облучения 100 Гр . В пределах изученных доз (100 - 1000 Гр) зависимость частоты мутаций сдвига рамки считывания от дозы носит линейный характер.

         Ранее на системе, позволяющей тестировать замены пар оснований, изучили закономерности индукции точечных мутаций под действием ?-излучения. В настоящее время ведутся работы по изучению индукции точечных мутаций под действием ионизирующей радиации с разными физическими характеристиками. Были определены закономерности образования трансверсии АТ - ТА в диплоидных клетках дрожжей под действием ускоренных ядер гелия. Показано, что зависимость частоты мутаций от дозы в пределах до 1000 Гр носит нелинейный характер. Ядра гелия с ЛПЭ 80 кэв/мкм индуцирует трансверсии менее эффективно, чем эти частицы с ЛПЭ 20 кэв/мкм и гамма-излучение.

         Продолжены работы по изучению генетического контроля остановки клеточного цикла при получении повреждений ДНК, так называемый checkpoint -контроль. Для выяснения картины разветвленных путей checkpoint-контроля анализировали взаимодействие между генами RAD9, RAD24, RAD53 и генами SRM5/CDC28, SRM8, SRM12.  Оказалось, что  ген CDC28 взаимодействует эпистатически с геном RAD9, но аддитивно с геном RAD53. Таким образом, протеинкиназа CDC28   и киназа RAD53 контролируют разные пути, определяющие радиочувствительность клеток. Гены RAD9 и RAD24 эпистатичны по отношению к гену RAD53 в отношении чувствительности к гамма-излучению, что не противоречит литературным данным полученным при анализе остановки клеточного цикла в ответ на повреждения ДНК. Взаимодействие генов RAD9 и RAD24 сложнее, двойной мутант более радиорезистентен, чем самый чувствительный из одиночных мутантов. Скорее всего, они действуют в разных направлениях на одном пути.

         Продолжен анализ генов SRM1, SRM2, SRM5, SRM8, SRM12 в отношении чувствительности к летальному и мутагенному действию УФ- и  гамма-излучения, влиянию мутаций в этих генах на прохождение клеточного цикла.

          В экспериментах с бактериальными клетками были продолжены исследования по индукции точковых мутаций (образование col B и ton B мутантов) и делеций (образование ton B trp- мутантов) при гамма-облучении и действии ускоренных тяжелых ионов. Установлено, что частота образования col B и ton B мутантов описывается линейно-квадратичными зависимостями при действии всех видов использованных излучений (гамма-лучи, ионы гелия с ЛПЭ = 20 и 78 кэВ/мкм, ионы углерода с ЛПЭ = 200 кэВ/мкм).  Квадратичный участок дозовой кривой мутагенеза параллельно сдвигается относительно зависимости при g-облучении с изменением ЛПЭ тяжелых заряженных частиц. Наибольшей биологической эффективностью, равной  2,8,  обладают ионы гелия с ЛПЭ = 20 кэВ/мкм и зависимость относительной биологической эффективности (ОБЭ) от ЛПЭ описывается  кривой с локальным максимумом в этой области. Частота образования делеционных мутаций линейно зависит от дозы, как гамма-облучения, так и действия ускоренных ионов гелия и углерода (ЛПЭ = 78 и 200 кэВ/мкм, соответственно). Наибольшей биологической эффективностью обладают ионы гелия.

         Были продолжены опыты по изучению SOS-ответа клеток E.coli методом SOS-люкс теста при действии тяжелых заряженных частиц (дейтонов, ЛПЭ 5 и 9 кэВ/мкм), ионов гелия (ЛПЭ 20, 40 и 80 кэВ/мкм), ионов углерода (200 кэВ/мкм). Установлено, что зависимость SOS induction potency (SOSIP) от ЛПЭ частиц описывается кривой с локальным максимумом в области 50-60 кэВ/мкм.

         Полученные на бактериях данные свидетельствуют о том, что в формировании генных мутаций у бактериальных клеток при действии разных видов излучений играют решающую роль повреждения ДНК комплексного типа. В отличие от этого делеционные мутации формируются, главным образом, из образующихся прямых и энзиматических двунитевых разрывов ДНК.

         На бактериях E.coli начаты работы по исследованию закономерностей и механизмов индукции эксцизии мобильных элементов ионизирующими излучениями с разными физическими характеристиками. Мобильные элементы являются дискретными генетическими структурами  и представляют собой участки ДНК, способными перемещаться из одного положения бактериального генома в другое. Среди них можно выделить транспозоны устойчивости к антибиотикам, которые не только вызывают интактные транслокации в различные сайты генома, но и определяют устойчивость штамма к антибиотику.

         Встраивание транспозона начинается с ковалентного включения дискретных, генетически стабильных терминальных последовательностей - прямых или обратных повторов и приводит к транслокации всего элемента в сайт гена-мишени за счет как гомологичной rec A - зависимой, так и негомологичной рекомбинации. Наряду с транслокацией может происходить процесс элиминации транспозона из генома, который приводит к потере резистентности к антибиотику и определяется точностью вырезания, а затем интеграции в новое положение. В экспериментах была использована новая система  для мониторинга и изучения индуцированной мутабильности  (Алешкин и др., 1983) , основанная на индукции точной эксцизии транспозонов различными мутагенами. Точная эксцизия транспозонов является специфическим SOS-мутагенным процессом, в результате которого  образуются делеционные мутации. Это связано с процессом формирования делеций, в котором, как было показано ранее, участвуют прямые или инвертированные IS -последовательности   транспозонов. Этот процесс используется для изучения мишенной и не мишенной SOS-мутабильности и связи с ключевыми генами SOS-мутагенеза.

         Кардинально отличаясь от точковых мутаций по природе клеточной мишени для SOS-мутабильной машинерии, точная эксцизия транспозонов предполагает возможность обращения к процессам SOS-мутабильности, в ходе функционирования которой, формируются геномные делеции, что подтверждает участие в их формировании прямых повторов ДНК или палиндромных последовательностей.

         Получены кривые выживаемости штаммов E. coli  дикого типа и репарационно-дефицитных  (recA, recN), несущих различные транспозоны - Tn5 и  Tn10, и определен характер зависимости частоты элиминации транспозонов от дозы гамма -облучения. Кривые выживаемости изучаемых штаммов носят экспоненциальный  характер.  Показано, что зависимость частоты элиминации  Tn10 от дозы гамма -облучения имеет характер кривой с насыщением, которое достигает максимума - (для клеток дикого типа) и полностью отсутствует индукция эксцизии транспозона при мутации в гене  recA. У  recN -мутантов кривая занимает промежуточное положение.

         Полученные результаты согласуются с данными других авторов и дают основание полагать, что гены recA и  recN не только вовлечены в репарацию повреждений ДНК, но и осуществляют контроль индукции вырезания и встраивания транспозона Tn10 в геноме E. coli.

         Были продолжены работы по изучению действия малых доз ионизирующей радиации в лабораторных экспериментах (на семенах гороха) и сочетанного действия на популяции подорожника, произрастающего в Балаковском районе Саратовской области и подвергающегося воздействию радионуклидных и химических загрязнений. Изучали (совместно с Институтом Биохимической физики РАН) изменения физико-химических процессов (антиоксидантный статус семян), цитогенетические нарушения (выход клеток с хромосомными аберрациями корешков проростков семян и митотическую активность) и адаптивный ответ апикальных клеток растений. Проведенные исследования показали наличие изменений (по использованным критериям) в исследованных образцах по сравнению с контрольными участками.

         Продолжены работы по математическому моделированию влияния малых доз облучения на организм. На основе модели двух защитных реакций выполнен анализ стохастических радиобиологических эффектов при малых дозах  облучения  различных биологических объектов. Стохастическими эффектами являлись опубликованные в последнее десятилетие результаты эпидемиологических наблюдений смертности от рака людей, выход апоптоза тимоцитов у мышей и различного вида аберрации хромосом. Результаты анализа показали, что в зависимости от природы биологического объекта, спонтанного эффекта, условий облучения и вида излучения реализуется та или иная форма взаимосвязи доза ? эффект: надлинейная выпуклостью вверх, близкая к линейной, или подлинейная (выпуклостью вниз), в том числе и с эффектом гормезиса. Этот результат свидетельствует о неполном соответствии наблюдаемым эффектам рекомендаций 1990 г. Международной комиссии по радиологической защите (МКРЗ), основанным на линейной беспороговой гипотезе о взаимосвязи доза - эффект. Вследствие этого методология оценки радиационного риска, рекомендованная МКРЗ, нуждается в уточнении, а такую величину, как коллективную дозу облучения, следует перевести в категорию нелепостей.